Jak se postupy vitrifikace vyvíjely v průběhu času

Vitrifikace nebyla jedním vynálezem. Vznikla postupným řešením různých problémů u buněk, embryí, orgánů a nakonec i lidské biostáze.

Cíl zní jednoduše: ochladit vodou bohatou tkáň do sklovitého stavu bez tvorby poškozujícího ledu.

Realizace však není jednoduchá. Kryoprotektanty mohou být toxické. Jejich aplikace může deformovat buňky. Velké objekty chladnou nerovnoměrně, hromadí napětí a je mnohem obtížnější je opět zahřát.

Moderní postupy jsou proto systémy, nikoli recepty. Jejich kvalita závisí na spolupráci chemie, perfuze, teploty, načasování, geometrie a měření.

Před vitrifikací: chlad způsoboval druhou újmu

Raná kryoprezervace spočívala především v mrazení. Ochlazení zpomalilo chemické reakce, avšak voda krystalizovala v led.

Led vylučuje soli a další rozpuštěné látky do zbývající kapaliny. Buňky tak mohou současně zažívat mechanické posunutí, extrémní koncentrace solutů, dehydrataci a poškození membrán.

Rychlejším ochlazením lze vytvořit menší krystaly, avšak obyčejná voda vyžaduje k přeměně ve sklo bez chemické pomoci mimořádně vysoké rychlosti. To funguje pouze u extrémně tenkých vzorků.

Historickým problémem nebylo pouze dosažení nízké teploty. Bylo to dosažení nízké teploty bez umožnění reorganizace vody do poškozujících krystalů.

1937 do 1938: první kinetické experimenty vitrifikace

Basile Luyet navrhl vitrifikaci jako strategii biologické konzervace v roce 1937.

V 1938 Luyet a Eugene Hodapp uvedli obnovení pohyblivosti u ptačího spermatu vystaveného tekutému vzduchu po dehydrataci koncentrovanou sacharózou.

„původní experimentzáviselo na mikroskopických filmech a extrémní rychlosti ochlazování. Ukázalo fyzickou možnost, nikoli škálovatelný protokol pro orgány.

Tento přístup se nyní nazývá kinetická vitrifikace: předběhnout krystalizaci odstraněním tepla rychleji, než může led nukleovat a růst.

Měřítko jej poráží. Plocha roste pomaleji než objem, takže střed velkého vzorku nemůže dostatečně rychle sledovat povrch.

1949: glycerol mění problém

Christopher Polge, Audrey Smith a Alan Parkes objevili v 1949, že glycerol může chránit spermie během nízkoteplotní konzervace.

Jejichzpráva Nature stanovila praktický význam pronikavých kryoprotektivních látek.

Tyto molekuly vstupují do buněk, vážou vodu a snižují množství ledu vytvořeného při dané teplotě. Také snižují koncentraci poškozujících solutů během zmrazování.

Objev změnil kryobiologii, protože rychlost ochlazování již nebyla jediným řídicím parametrem. Chemické složení mohlo přetvořit fázové chování vody.

Zaváděl také nový optimalizační problém. Více kryoprotektantu účinněji potlačuje led, ale zvyšuje chemické a osmotické poškození.

1959 do 1968: více látek a stupňovité zatěžování

V 1959 James Lovelock a Marcus Bishop uvedli, že dimethylsulfoxid chránil několik typů buněk před poškozením mrazem.

DMSO pronikalo některými membránami snadněji než glycerol. Rozšířilo spektrum buněk, které mohly být kryoprotektivně chráněny, a zůstává široce používáno v laboratorní a klinické kryoprezervaci.

John Farrant poté prozkoumal zvyšování koncentrace kryoprotektantu při snižování teploty, přičemž tkáň udržoval v koncentrované kapalině bez záměrného vytváření ledu.

Tím předjímal základní rys moderních protokolů: kryoprotektant zatěžovat postupně, při nízké teplotě, místo toho, aby byla teplá tkáň vystavena plné koncentraci najednou.

Postupné zatěžování omezuje osmotický šok. Nižší teplota snižuje rychlost mnoha chemických reakcí a může učinit jinak poškozující expozici snesitelnější.

V 1968 ukázaly experimenty, že červené krvinky mohou dosáhnout teploty kapalného dusíku bez viditelného ledu při dostatečně vysoké koncentraci glycerolu.

Konceptuální prvky byly přítomny. Chyběl však praktický způsob, jak je aplikovat na složitou, vaskularizovanou tkáň.

1984: vitrifikace se stává strategií pro orgány

Článek 1984„Vitrifikace jako přístup ke kryoprezervaci“ přeformuloval vitrifikaci jako seriózní cestu k uchovávání orgánů.

Strategie byla někdy nazývána rovnovážnou vitrifikací. Místo požadavku na nemožnou rychlost ochlazování se používá dostatek kryoprotektantu, aby byla dosažitelná kritická rychlost ochlazování v rozsáhlejším systému.

Tento posun odhalil tři vzájemně propojená omezení:

• Řešení musí odolat ledu při dosažitelných rychlostech chlazení a ohřevu.
• Orgán musí snést zatížení a odlehčení tohoto roztoku.
• Kryoprotektivum musí dosáhnout každé oblasti před zahájením chlazení.

Složení by mohlo v zkumavce fungovat skvěle a selhat v orgánu, protože cévní odpor, difuzní vzdálenost nebo toxicita změnily výsledek.

1985: živé embryo se vrací ze sklovitého stavu

William Rall a Gregory Fahy uvedlibezledou kryoprezervaci myších embryí v rámci -196°C v 1985.

Šlo o rozhodující biologickou demonstrací. Živé jaderné savčí buňky přežily chlazení a opětovné ohřátí prostřednictvím zcela zeskelnatělého stavu.

Embrya jsou stále malá. Jejich teplota a koncentrace se mohou rychle a rovnoměrně změnit ve srovnání s dospělým orgánem.

Výsledek metodu validoval, přičemž problém měřítka učinil zřetelnějším.

Problém měřítka se dělí na čtyři dílčí problémy

1. Toxicita kryoprotektiv

Koncentrace potřebná pro zeskelnatění může narušit proteiny, membrány a buněčný metabolismus. Toxicita závisí na činidle, koncentraci, teplotě, době expozice a typu tkáně.

To znamená, že „méně toxický“ není vlastností jediné molekuly samotné. Je to vlastnost úplného protokolu zatížení a odlehčení.

2. Osmotický stres

Přidání koncentrovaného roztoku vytahuje vodu z buněk. Jeho odstranění může naopak vodu vtáhnout zpět příliš rychle.

Moderní protokoly využívají rampy koncentrace, nosné roztoky, kontrolu teploty a nepronikající látky, aby udržely objemové výkyvy v únosných mezích.

3. Nerovnoměrné dodání

Orgán není nádoba s rovnoměrnou tekutinou. Kryoprotektivum prochází cévami, překračuje stěny kapilár a difunduje tkání.

Sraženiny, edém, cévní onemocnění, ischémie a hematoencefalická bariéra mohou některé oblasti ponechat pod koncentrací potřebnou k potlačení ledu.

Proto moderníperfúze měří tlak, průtok, teplotu a venózní koncentraci spíše než spoléhá pouze na objem roztoku.

4. Tepelné gradienty

Velký objekt chladne od vnějších vrstev dovnitř. Různé teploty způsobují různé rychlosti smrštění.

V blízkosti a pod teplotou skelného přechodu materiál nemůže rychle uvolňovat napětí. Pokud napětí překročí jeho mechanickou pevnost, mohou vznikat trhliny.

Řízené ochlazování roztoku, žíhání v blízkosti Tg a pomalejší sestup skelnou oblastí. Tyto principy nyní formujípočítačem řízené ochlazování lidského těla.

Směsi 1990 a 2000 nahrazují myšlení založené na jednotlivých látkách

Žádný kryoprotektant nebyl optimalizován pro všechny požadavky. Výzkumníci stále častěji kombinovali pronikající látky, aby každá mohla přispět bez dosažení své nejhorší individuální koncentrace.

Nosné roztoky regulovaly ionty, pH a osmotické podmínky. Nepřekonávající polymery ovlivňovaly chování vody v tkáni a cévní systém.

Syntetické blokátory ledu cílily na heterogenní nukleaci a růst ledu. Snížily tak závislost pouze na brutální koncentraci kryoprotektantu.

Řešení jako VS55 a později M22 představovala systémové inženýrství: více látek, blokátory ledu a pečlivě navržená chemie nosných roztoků v kombinaci s definovanými protokoly perfuze a teplotními režimy.

Článek2004 review of organ vitrification popisuje pokroky v redukci toxicity, poškození chladem, kontrole nukleace a perfuzi orgánů.

Důležitým pokrokem nebylo to, že toxicita zmizela. Výzkumníci se naučili rozložit zátěž napříč chemií, časem a teplotou.

Pokusy na králíčích ledvinách: významné a snadno se nadhodnocují

Práce na ledvině králíka prokázala, že vaskularizovaný savčí orgán lze naplnit komplexním vitrifikačním roztokem, ochladit do sklovitého stavu, znovu ohřát a transplantovat.

Jeden hlášený případ ledviny podporoval králíka jako jeho jediný funkční ledvinu po prodloužené období.

Tento výsledek je významný, protože překročil hranici od mikroskopických vzorků k funkci orgánu. Nepodařilo se však stanovit spolehlivý klinický postup.

Pozdější literatura uvádí, že dlouhodobý úspěch transplantace nebyl reprodukovatelný. Distribuce, toxicita a konvenční povrchové ohřívání zůstávaly limitujícími faktory.

Toto je správný epistemický status: významný důkaz principu s problémem reprodukovatelnosti a měřítka.

2015: kvalita konzervace se stává viditelnou na synaptické úrovni

Kryoprezervace stabilizovaná aldehydy kombinovala chemickou fixaci, perfuzi kryoprotektantem a vitrifikaci v mozcích králíků a prasat.

Studie2015 hlásila po opětovném ohřátí a přípravě pro elektronovou mikroskopii jasné membrány, synapse, vezikuly, myelin a intracelulární struktury.

Ukázalo se, že vynikající ultrastruktura neuronů může přežít cyklus skladování bez ledu i u velkých mozků.

Nezdokumentovalo však životaschopné zotavení. Fixace aldehydem záměrně vytváří příčné vazby v biologickém materiálu a je neslučitelná s obvyklým obnovením životních funkcí.

Experiment tedy zodpověděl strukturální otázku, nikoli otázku úplného oživení.

Jeho širší přínos byl metodologický: zachování by mělo být posuzováno prohlídkou struktur, které nás zajímají, nikoli pouze pozorováním, že vzorek vypadá sklovitě.

2023: nanohřátí řeší opětovné zahřátí u ledvin potkanů

Chlazení je pouze polovinou reverzibilní kryoprezervace. Opětovné zahřátí je často obtížnější.

Pokud je zahřívání příliš pomalé, led může růst během devitrifikace. Pokud teplo přichází převážně z povrchu, teplotní gradienty mohou orgán rozlomit.

Nanohřátí řeší oba problémy tím, že distribuuje nanočástice oxidu železa skrz cévní systém a zahřívá je střídavým radiofrekvenčním magnetickým polem.

V 2023 výzkumnícivystudili ledviny potkanů, skladovali je až 100 dní, nanohřáli je a transplantovali je.

Obnovené ledviny obnovily život udržující renální funkci u příjemců bez vlastních ledvin během hlášeného následného sledování.

Tento úspěch nebyl závislý pouze na zahřátí. Tým přešel na méně toxickou formulaci a modeloval zatížení kryoprotektantem za účelem zlepšení koncentrace tkáně.

Toto je opakující se lekce z historie vitrifikace: vyřešení jednoho úzkého místa odhaluje další, a úspěšné obnovení vyžaduje celý řetězec.

2024 do 2026: větší fyzické systémy a funkční nervová tkáň

Ve 2024 výzkumníci hlásilifyzickou vitrifikaci na lidské orgánové škáleve 0.5 do 3 litrových systémech.

Kombinovali vnitřní termometrii, žíhání, řízené ochlazování a inspekci pomocí mikro-CT. Dále demonstrovali nanohřátí ve svazcích až do 2 litrů.

Největší demonstrace byly primárně fyzikální. Vyhnutí se viditelnému ledu a prasklinám je nezbytné, ale nezaručuje biologické obnovení lidského orgánu.

Ve 2026 studie v časopisePNAShlásila krátkodobé funkční obnovení dospělé myší hippokampální tkáně po vitrifikaci a opětovném zahřátí.

Studie měřila morfologii, mitochondriální reaktivitu, neuronální excitabilitu, synaptickou transmisi a dlouhodobé potenciace.

Zahrnovala myší mozkové řezy a přípravky celého mozku s nízkým výtěžkem, nikoli lidský mozek. Její význam je užší, avšak stále podstatný.

Ukázala, že dospělá savčí nervová tkáň může obnovit elektrofyziologické funkce poté, co byla molekulární pohyblivost zastavena ve sklovitém stavu.

Lidská biostáze zdědila vědu za obtížnějších podmínek

Experimenty s uchováváním orgánů začínají se zdravou tkání, kontrolovaným načasováním a plánovaným přístupem k cévnímu systému.

Lidská biostáze začíná po právní smrti. Nemoc, teplá ischémie, srážení, edém, transport a cévní onemocnění mohou všechny narušit dodávku kryoprotektantu.

Bezprostředním cílem je strukturální zachování pro případnou budoucí opravu, nikoli současnou reverzibilní transplantaci.

Tento rozdíl je důvodem, proč nelze laboratorní tvrzení přímo převádět na tvrzení o pacientech.

Jak společnost Tomorrow.bio přizpůsobila vitrifikaci pro terénní podmínky

Společnost Tomorrow.bio přesunula celotělovou kryoprotektivní perfuzi do specializovaných ambulancí. Postup lze zahájit v blízkosti pacienta, aniž by bylo nutné čekat na transport do Švýcarska.

Tím se mění důležitý vstup, který chemie nedokáže opravit: množství ischémie před perfuzí.

Současný protokol využívá chemie roztoku založené na VM-1, upravené pro terénní kryoprotekci a následný transport suchým ledem.

Program výzkumuEuropean Biostasis Foundation testoval VM-1 v simulovaných posmrtných podmínkách, včetně tříhodinové teplé ischémie.

Program měřil index lomivosti žilní krve, dobu perfuze, změnu hmotnosti, smrštění mozku a tvorbu ledu při testování změn perfuzátu a postupu.

Toto je praktická hranice pro lidské případy: nikoli zda ideální roztok může vitrifikovat, ale jak dobře lze perfundovat skutečného ischemického pacienta.

Měření se stalo součástí postupu

Výzkum rané vitrifikace často stanovoval úspěch prostřednictvím průhlednosti, kalorimetrie, rentgenové difrakce, přežití nebo funkce po opětovném ohřátí.

Lidská biostáze nemůže v současnosti používat zotavení jako koncový bod. Proto potřebuje nedestruktivní a odebírané měření kvality zachování.

Společnost Tomorrow.bio provádí CT skenování každého pacienta při stejné teplotě kapalného dusíku, aby odhadla distribuci kryoprotektantu a identifikovala led nebo makroskopické vady za standardizovaných podmínek.

Se samostatným souhlasem lze odebírat mikrovzorky nervové tkáně k podpoře hodnocení membrán, synapsí a lokální ultrastruktury pomocí elektronové mikroskopie.

Tyto metody a jejich limity jsou popsány vBiostasis Codex.

Měření mění samotný vývoj. Když selhání je viditelné a srovnatelné napříč případy, mohou změny chemie a protokolu cílit právě na ně.

Co se zlepšilo a co dosud nebylo vyřešeno

Moderní vitrifikace dosáhla několika věcí, kterých rané zmrazení nebylo schopno:

• Bezledá konzervace mnoha buněk, embryí a malých tkání.
• Funkční obnovu vitrifikovaných zvířecích orgánů v definovaných experimentech.
• Strukturální zachování na úrovni synapsí v fixovaných savčích mozcích.
• Počítačem řízené chlazení a žíhání větších systémů.
• Objemové ohřev prostřednictvím technologií, jako je nanowarming.
• CT a metody elektronové mikroskopie pro měření skutečných výsledků konzervace.

Nedosáhla reverzibilní konzervace celého lidského těla.

Zbývající problémy zahrnují postmortální ischemii, nerovnoměrnou perfúzi, toxicitu kryoprotektantů, účinky na hematoencefalickou bariéru, tepelné gradienty v celém těle, zabránění praskání a bezpečné jednotné ohřátí.

I úspěšné strukturální zachování by ponechalo budoucí problémy opravy, oživení a léčby původní příčiny smrti.

Tyto rozdíly jsou rozvinuty vtechnických výzvách reverzibilní kryokonzervace.

Další čtení

• Stručné dějiny kryoniky
• Jak fungují kryoprotektivní látky
• Fyzikální a biologické aspekty ledvinové vitrifikace
• Vitrifikace a nanohřátí transplantovaných ledvin potkanů
• Fyzikální vitrifikace a nanohřátí na úrovni lidských orgánů