Pokrok v oboru

Kryonika není jednoduchý postup typu ochladit, uložit a čekat. Je to aktivní vědecký obor a rozdíl mezi konzervací provedenou v roce 1970 a konzervací provedenou dnes je velký a měřitelný. Každé zlepšení zachování ultrastruktury mozku zvyšuje šanci, že budoucí medicína jednou umožní probuzení se zachovanou pamětí, osobností a identitou. Tento článek popisuje, jak se obor posouvá dopředu, co už bylo prokázáno, co ještě ne a kdo na tom pracuje.

Obor, nikoli jediná technika

Rozhodující obrat nastal od zamrazování k vitrifikaci, tedy přechodu tkáně nasycené kryoprotektivy do sklovitého stavu bez ledu. Kryobiolog Greg Fahy tento postup navrhl v roce 1984 a při kryokonzervaci lidí se začal používat kolem roku 2000.

Vitrifikace nevznikla jako hotová metoda, protože bylo nutné vyřešit několik zásadních problémů. Koncentrace kryoprotektiv potřebná k potlačení tvorby ledu bývá natolik vysoká, že je toxická. Vývoj vitrifikačních roztoků proto směřuje k co největšímu rozdílu mezi koncentrací potřebnou k vitrifikaci a koncentrací, která buňky poškozuje nebo usmrcuje.

Čtyři problémy, na kterých obor pracuje

1. Toxicita kryoprotektiv. Jde o klíčový problém a standardní referenční text ho popisuje bez obalu. Human Cryopreservation Procedures Referenční text Human Cryopreservation Procedures od de Wolfa a Platta, jehož věcnou správnost ověřil Brian Wowk, to shrnuje takto: skutečnou výzvou kryobiologie není navrhnout roztoky, které odolají vzniku ledu při pomalém chlazení, ale navrhnout vitrifikační roztoky bez toxicity.

Pokrok nepřinesl jediný průlom, ale řada konkrétních zlepšení ve složení roztoků. Toxicita některých kryoprotektiv se při kombinaci s jinými látkami snižuje. Známým příkladem je Fahyho zjištění, že DMSO zmírňuje toxicitu formamidu. Souhrnná proměnná označovaná qv* umožňuje odhadovat celkovou toxicitu vitrifikačního roztoku a posunula návrh receptur od empirického zkoušení k systematičtějšímu postupu. Její použití přineslo zdánlivě neintuitivní výsledek: méně účinné látky podporující tvorbu skla mohou zvýšit viabilitu buněk. Vyšší koncentrace ethylenglykolu namísto propylenglykolu proto zvýšila buněčnou viabilitu. Syntetické inhibitory tvorby ledu řeší tentýž problém jiným způsobem. V roce 2000 Brian Wowk a jeho kolegové prokázali, že polymery mohou potlačovat heterogenní nukleaci ledu. Kopolymery polyvinylalkoholu a polyglycerolu, prodávané jako X-1000 a Z-1000, snižují minimální koncentraci kryoprotektiva potřebnou k dosažení vitrifikace. Nižší potřebná koncentrace kryoprotektiva znamená i nižší toxickou zátěž.

Současný stav tohoto problému dokumentuje tatáž referenční práce. V případech provedených za dobrých podmínek se předpokládá, že viabilita mozku se ztrácí v raných až středních fázích kryoprotektivní perfuze, a to působením toxicity kryoprotektiv a dehydratace, kterou způsobují. Zachování ultrastruktury a zachování viability nejsou totéž. V současnosti je dosažitelné především zachování ultrastruktury.

2. Dostat kryoprotektivum do celého mozku. German a kolegové jasně vysvětlují, proč je konzervace celého mozku náročnější než práce s malým vzorkem tkáně. Kryoprotektivum se musí dostat do tkáně cévním řečištěm, přičemž propustnost a hydraulická vodivost na hematoencefalické bariéře nejsou vyvážené kvůli vysoké koncentraci akvaporinu 4 v perivaskulárních výběžcích astrocytů. Jejich protokol pro celý mozek uspěl v jednom ze tří pokusů. Akvaporiny označují za slibný cíl pro přímý zásah.

3. Ohřát tkáň zpět na vyšší teplotu. Ohřev je náročnější polovina celého cyklu. Při chlazení je třeba zabránit vzniku ledu během jediného průchodu kritickým teplotním rozmezím. Při ohřevu jím však tkáň prochází pomaleji, a led, který při chlazení nevznikl, se může vytvořit právě tehdy. Kondukční ohřev postupuje od povrchu směrem dovnitř, a proto je omezen maximální velikostí tkáně, kterou lze tímto způsobem ještě bezpečně ohřát. Nad touto hranicí jsou nutné objemové metody. V roce 2023 skupina z University of Minnesota vitrifikovala ledviny krys, uchovala je až 100 dní a poté je ohřála průměrnou rychlostí 63,7 °C za minutu pomocí nanočástic oxidu železa obalených silikou, které byly buzeny v radiofrekvenčním poli. Ledviny následně transplantovala a zvířata díky nim přežila. Ve stejném roce dosáhla skupina Ramona Risca v Seville rychlosti 217,8 °C za minutu pomocí vysoce intenzivního fokusovaného ultrazvuku. Ten přivádí teplo do celého objemu a nevyžaduje přítomnost nanočástic v tkáni. Práce z roku 2025 rozšířila vitrifikaci a nanoohřev na objemy v řádu litrů. Žádná z metod nebyla zatím zkoušena na tkáni o velikosti lidského mozku.

4. Praskání pod teplotou skelného přechodu. Pod teplotou skelného přechodu se materiál dále smršťuje, ale napětí už nedokáže uvolňovat relaxací. Může se proto uvolnit vznikem trhlin. Studie z roku 2025 prokázala, že praskání sleduje smršťování tkáně a teplotní gradienty vznikající při rychlém chlazení. Tento problém lze zmírnit pomalým ochlazováním na kryogenní teploty a skladováním při mezilehlé teplotě.

Co bylo prokázáno a v jakých systémech

Následující tvrzení jsou seřazena podle toho, co konkrétní experiment skutečně prokázal a v jakém systému.

Celý orgán po vitrifikaci a transplantaci. Fahyho skupina v 21st Century Medicine uvedla v roce 2009, že králičí ledvina perfundovaná vitrifikačním roztokem M22, zchlazená na −135 °C bez tvorby ledu, následně ohřátá a transplantovaná, fungovala jako jediná ledvina zvířete. Zůstává to nejjasnějším důkazem, že komplexní orgán může přežít celý cyklus.

Ultrastruktura zachovaná v celém mozku po fixaci. Metoda kryoprotektivní konzervace stabilizované aldehydem, publikovaná v časopise Cryobiology v roce 2015, získala v roce 2018 cenu Brain Preservation Foundation v kategorii velkých savců. Zachovala synaptickou konektivitu v celém mozku prasete, což po ohřevu ověřila trojrozměrná elektronová mikroskopie. Glutaraldehyd se v tomto postupu používá k úvodní fixaci ultrastruktury, což biologické probuzení takové tkáně vylučuje. Výhody a nevýhody postupu popisuje článek Konzervace bez zamrazení.

Ultrastruktura zachovaná v celém mozku samotnou vitrifikací. Preprint z roku 2026 od Fahyho, Ralfa Spindlera, Briana Wowka a kolegů popisuje ultrastrukturální a histologickou kryokonzervaci mozků savců vitrifikací bez předchozí fixace aldehydem. Recenzní řízení ještě neproběhlo.

Obnovení funkce v myším hipokampu. V březnu 2026 Alexander German a kolegové z Erlangen-Norimberku publikovali práci o funkčním obnovení dospělého myšího hipokampu po kryokonzervaci vitrifikací v časopise PNAS. Řezy i celé mozky in situ byly udržovány pod teplotou skelného přechodu po dobu od deseti minut do sedmi dní, poté ohřáty a vyšetřeny. Obnovil se klidový membránový potenciál, synaptický přenos, metabolická odpověď i dlouhodobá potenciace. LTP dosáhla 138,06 ± 6,90 % po vitrifikaci proti 157,68 ± 7,14 % u kontrolní skupiny, p = 0,072, na sedmi a osmi řezech ze sedmi myší. Tento rozdíl není statisticky významný, ale při takové velikosti vzorku nelze vyloučit ani reálný pokles, a autoři výsledek popisují jako krátkodobé zotavení. Výsledek ukazuje, že buněčný mechanismus související s učením a pamětí zůstal funkční i po úplném zastavení molekulárního pohybu v myším hipokampu po dobu několika dní. Nejde o výsledek platný pro lidský mozek, celé orgány v lidském měřítku ani pro dlouhé doby uložení. PNAS k tomu v červnu 2026 zveřejnilo nezávislý komentář.

Lidská mozková tkáň po uchování a obnovení funkce. V roce 2024 skupina z Fudanské univerzity publikovala protokol, který nazvala MEDY, založený na methylcelulóze, ethylenglykolu, DMSO a Y27632. Po rozmrazení si lidská mozková tkáň a neurální organoidy udržely strukturu, buněčnou rozmanitost i neurální funkci.

Jak se měří kvalita konzervace

Pojem měření kvality se používá pro dvě odlišné věci. Jejich zaměňování může vést k tomu, že se za důkaz výsledku vydávají pouze příznivé provozní ukazatele. Jedna skupina ukazatelů měří skutečný výsledek konzervace. Druhá skupina ukazatelů měří zátěž, kterou pacient podstoupil během procesu. Obojí patří do záznamu případu, ale důkazem o výsledku je jen to první.

Výsledkové ukazatele: čeho konzervace dosáhla

Referenční text uvádí tři ukazatele, z nichž každý se hodnotí vlastní metodou. Absence tvorby ledu se hodnotí CT vyšetřením, které rozliší vitrifikované oblasti od zmrazených, protože led a okolní vitrifikovaný roztok se liší hustotou. Zachování ultrastruktury se hodnotí elektronovou mikroskopií na mikrolitrových vzorcích mozkové tkáně. Viabilita se u stejných vzorků hodnotí testy, například poměrem draslíku k sodíku. Tato referenční práce stanovuje standard jasně: každá zpráva o případu by měla obsahovat CT snímky a elektronové mikrofotografie dokumentující dosažený stupeň vitrifikace a zachování ultrastruktury.

Tatáž referenční práce u třetího ukazatele otevřeně uvádí, že vysoké hodnoty viability ve vzorcích mozku pacientů dnes nejsou dosažitelné, zejména kvůli výše popsané toxicitě. Za kvalitní případ se dnes považuje takový, který prokáže vitrifikaci a zachování ultrastruktury, nikoli vysokou viabilitu.

Ukazatele zátěže: co pacient prodělal

S-MIX, standardizovaná míra ischemické zátěže, převádí průběh teploty a krevního oběhu v konkrétním případě na ekvivalentní minuty ischemie při normální tělesné teplotě. Teplé ischemii přitom přisuzuje větší váhu než studené. Druhým ukazatelem je počáteční rychlost chlazení normalizovaná na hmotnost pacienta. Tyto ukazatele umožňují porovnávat jednotlivé případy a hodnotit dopad změn v protokolech. Popisují podmínky, za kterých konzervace probíhala. Nevypovídají o tom, jak dopadla.

Co měří Tomorrow.bio

U každého našeho případu se provádí CT vyšetření, takže stupeň vitrifikace je doložen, nikoli pouze předpokládán. CT vyšetření jsme provedli u více pacientů a výsledky jsme zveřejnili u více z nich než kterákoli jiná organizace zabývající se kryokonzervací. Jednotlivé zprávy o případech jsou veřejně dostupné v plném znění. Elektronová mikroskopie vyžaduje výslovný souhlas s odběrem vzorku mozkové tkáně. Provádí se proto pouze u členů, kteří k tomu dali souhlas; dosud se to týká jednoho případu.

Tento rozdíl je důležitý při čtení tvrzení o kvalitě u jakékoli organizace: CT ukáže, zda vznikl led, ale jen elektronová mikroskopie ukáže, co se stalo se synapsemi.

Kdo na tom pracuje

21st Century Medicine se podílela na výsledku s králičí ledvinou, na konzervaci stabilizované aldehydem, na rámci qv*, na roztoku M22 i na vývoji syntetických inhibitorů tvorby ledu. Právě zde vznikla velká část chemických postupů a kryoprotektiv používaných dnes.

Skupina Alexandera Germana na univerzitě Erlangen-Norimberk provedla výše popsanou práci o obnovení funkce. German je klinický vědec v oboru molekulární neurologie a spoluzakladatel firmy Hiber, která se věnuje strukturální konzervaci mozku.

Advanced Neural Biosciences, který v roce 2008 založili Aschwin de Wolf a Chana Phaedra, patří k několika málo institutům výslovně zaměřeným na kryobiologii mozku. Zabývá se vitrifikačními roztoky s nízkou toxicitou a viskozitou, které dobře pronikají hematoencefalickou bariérou, a také problémem no-reflow, kdy se po prodlevě nedaří tkáň znovu perfundovat. De Wolf je spoluautorem standardní referenční práce o postupech, citované v celém tomto článku.

Výzkum uchovávání orgánů poskytuje nástroje, které lze využít i v jiných oblastech. Práce z Minnesoty o nanoohřevu vznikla právě v této komunitě, nikoli v kryonice.

Konektomika pomáhá vymezit, jaké informace může mozková struktura nést. V roce 2025 konsorcium MICrONS publikovalo mapu jednoho krychlového milimetru zrakové kůry myši obsahujícího zhruba 200 000 buněk a 523 milionů synapsí, výsledek let práce mezinárodního konsorcia. Jde o malý objem malého mozku, přesto obsahující více synapsí, než se před deseti lety podařilo zmapovat.

Brain Preservation Foundation sama konzervaci neprovádí, ale významně se podílí na hodnocení výsledků prostřednictvím cen s veřejně dostupnými kritérii a nezávislého ověřování elektronovou mikroskopií.

Tomorrow.bio a European Biostasis Foundation se věnují praktické stránce oboru: pohotovostním a stabilizačním protokolům, perfuzním zařízením, logistice včasného zásahu u pacienta a dlouhodobému uložení v zařízení EBF v Rafzu ve Švýcarsku. Do zkušebního provozu se zde zavádí první dewar pro skladování při mezilehlé teplotě v měřítku lidského těla. Druhá laboratoř se staví v Berlíně. Většina výsledků popsaných v tomto článku pochází z práce jiných skupin.

Přehledová práce z roku 2024 o strukturální konzervaci mozku popisuje argumentaci i nejistoty v recenzovaném časopise. Mezi jejími autory je i Aschwin de Wolf.

Co by tuto argumentaci zpochybnilo

Existují tři výsledky, které by tuto argumentaci narušily, a každý z nich je typem výsledku, který by současný výzkumný program mohl přinést.

Pokud by se ukázalo, že dostat kryoprotektivum přes neporušenou hematoencefalickou bariéru v měřítku celého mozku je nemožné, výsledky na řezech by zůstaly zajímavé, ale ztratily by na relevanci. Pokud by se prokázalo, že současné protokoly synaptickou ultrastrukturu běžně nepoškozují, ale ničí, hlavní tvrzení by neobstálo. Pokud by se ukázalo, že dlouhodobá paměť závisí podstatně na trvající elektrické aktivitě a ne na zachované struktuře, konzervace by chránila nesprávnou věc.

Žádný z těchto výsledků se dosud nepotvrdil a dostupné důkazy ve všech třech případech směřují opačným směrem. Zůstávají to ale otázky, které stojí za to sledovat.

Proč záleží na směru vývoje

Nic z toho nemění, že probuzení v současnosti není možné. Mění se rychlost, s jakou se zlepšuje kvalita konzervace. Ta určuje, v jakém stavu by budoucí technologie musela zachovanou tkáň převzít. Čtyři oblasti výzkumu řeší různé části problému: kryobiologie, uchovávání orgánů, konektomika a klinická medicína. Výsledky se mezi nimi přenášejí. Možné cesty, jimiž by se tento vývoj mohl ubírat, popisuje článek Jak bychom mohli dosáhnout probuzení.

Doporučené čtení

• Relevantní výzkumné práce
• Medicínský nemrznoucí prostředek (kryoprotektiva)
• Jak bychom mohli dosáhnout probuzení
• Proč probuzení v současnosti není možné?